共聚焦显微稳态瞬态荧光光谱系统应用

显微稳态瞬态荧光光谱

荧光，是一种物质光致发光现象。物质产生荧光需要具备特定的结构和电子跃迁特性。通常，具有共轭双键体系、刚性平面结构以及特定的官能团等特征的分子更容易产生荧光。从微观角度分析，当物质分子受到光照射时，分子会在吸收光子能量时被激发，分子内的电子会从基态跃迁到激发态，处于激发态的电子是不稳定的，会在很短的时间内（通常在10⁻⁸到10⁻⁴秒之间）回到基态，同时以光的形式释放出多余的能量，这种发射出的光就被称为荧光。

图1 荧光原理图

荧光光谱在时域上分为稳态和瞬态荧光光谱。稳态荧光光谱主要研究物质在连续光源照射下的荧光信号，检测荧光信号/强度(y)是波长(x)的函数。瞬态荧光光谱主要研究物质在脉冲光源照射后，荧光信号/强度随时间的变化，一般检测的荧光信号/强度(y)是时间(x)的函数。瞬态荧光光谱又称荧光寿命曲线/时间分辨荧光光谱(TRPL),在瞬态荧光领域中，荧光寿命是对时间分辨荧光光谱的具体解释，其定义为荧光物质在吸收光能量后被激发到激发态后，从激发态返回到基态并释放荧光光子所需的平均时间。它是荧光现象的核心时间特性，反映了荧光分子与其周围微环境的相互作用，具有重要的科学和应用价值。相较于稳态荧光测量所获取的、反映激发态粒子系综平均行为的信号，荧光寿命测量则提供了激发态分子衰变动力学的直接信息。前者主要指示特定光物理过程或化学反应的发生，而后者通过解析激子态弛豫的速率常数，能够深入揭示导致该过程发生的具体物理机制。

稳态瞬态荧光光谱应用

1.材料科学

在半导体材料的发光特性测量应用中通常用激光激发材料产生荧光，利用荧光光谱分析材料的光学特性，单层MoS₂因直接带隙特性荧光Z强，随层数增加转变为间接带隙导致荧光骤减，即可从PL谱可判断MOS2层数。（参考文献：Krishna et al., Nanoscale, 2014, 6, 13028–13035；）

图2 荧光光谱与成像对MOS2薄膜的定性分析

关于真空沉积CH₃NH₃PbI₃（eMAPI）钙钛矿薄膜的研究中，稳态荧光和瞬态荧光谱技术扮演了互补且关键的角色。共同揭示了真空沉积钙钛矿薄膜（eMAPI）中光物理特性与器件性能之间的内在联系。图3. (A)稳态测量结果表明，基于eMAPI的太阳能电池实现了高达20.6%的转换效率和1.16 V的开路电压，证明了其优异的体相质量，但这与常规认知中长荧光寿命是高效率前提的观点相矛盾，因为eMAPI的荧光寿命极短。图3. (B)瞬态荧光技术作为核心分析手段，解决了这一矛盾。实验首先确认了eMAPI的超短荧光寿命（仅约0.75 ns），随后通过表面钝化实验发现，钝化后寿命显著延长至73.5 ns，这确凿地证明了其短寿命并非源于体相非辐射复合，而是由薄膜表面的快速非辐射复合所主导。

（参考文献：Jubok et al., J. Phys. Chem. Lett. 2019,10,5167-5172）

图3 非钝化与钝化情况下，eMAPI玻璃层的瞬态荧光

衬底作为二维材料紧密接触的支撑结构，其邻近掺杂效应可显著调控二维材料的光学特性。研究人员利用荧光寿命成像显微镜技术，说明邻近掺杂效应直接调控着MoS₂中载流子的生成与复合动力学过程。具体而言，ITO衬底上的MoS₂表现出显著的载流子寿命和荧光寿命缩短。这是由于随着载流子密度增加，材料中的缺陷捕获电荷的可能性增加，被捕获的载流子能保持更长的时间，减少它们对电荷传输的贡献并增加复合的可能性，进而使载流子寿命缩短。稳态瞬态荧光的检测表征技术揭示了衬底对二维材料光电性质的调控机理，为未来设计和优化高性能二维材料光电器件开辟了新途径，具有重要的科学意义和应用前景。（参考文献： Loc et al., Laser & Photonics Reviews.2025.e00682）

图4 单层MoS2在不同衬底上的 (a) 荧光特性 (b) 荧光寿命成像实验结果

2.生物医学

荧光光谱对疾病的早期预防和诊断具有无损检测的监测优势。通过荧光光谱对宫颈癌病变前后的样本进行检测，其光谱的高灵敏度可反映细胞代谢异常，能发现传统病理难以检测的微小病变（参考文献：Jeong et al., Journal of Biophotonics 2018;11(5):e201700245）

图5. 一个癌前病变CINIII的患者，两个不同部位的切片组织形态表现出差异，A为尚未病变，B为病变。C和D展现出一致的光谱特性

此外，瞬态荧光光谱及其荧光寿命成像对肿瘤细胞的的诊断也提供了依据，作为一种快速、灵敏且微创的辅助诊断手段通常会和内窥镜等医疗器械共同作用，凸显出稳态瞬态荧光光谱的应用潜力。

图6. 肺癌患者肿瘤交界区域的荧光寿命显微成像

3.药代动力学

基于稳态和瞬态荧光光谱，以高发光性的CA/EDA-CDs作为探针，对·OH具有选择性的荧光响应。通过荧光检测手段，实现了对氨茶碱（一种基于黄嘌呤的支气管扩张剂）的监测，CA/EDA-CDs 显示出高量子产率（56.56%），且其发射峰在450 nm处保持稳定，表明其具有激发独立性及其作为探针的优势，使用瞬态荧光光谱仪记录CA/EDA-CDs的寿命衰减，露于·OH后，引入破坏了共轭系统，平均荧光寿命从15.11 ns降至12.08 ns，表明·OH诱导了非辐射能量耗散。TCSPC则量化了这一过程对激发态动力学的动态影响。（参考文献：Yif et al., Materials Today Bio 33:102019）

图7. （A）探针及Fe-XOD酶催化系统检测氨茶碱（AMP）的可行性分析。（B）电子顺磁共振（ESR）。（C）紫外-可见吸收光谱。（D）CA/EDA-CDs的荧光发射过程示意图及由Fe²⁺+XOD催化AMP产生的·OH引起的CA/EDA-CDs能带结构变化及荧光猝灭机理。(E)CA/EDA-CDs, CA/EDA-CDs+AMP, CA/EDA-CDs+XOD, CA/EDA-CDs+Fe²⁺+XOD和CA/EDA-CDs+Fe²⁺+XOD+ AMP的荧光寿命衰减曲线。

4.荧光探针

瞬态与稳态荧光光谱技术的结合应用为荧光探针的开发和优化提供了多维度、深层次的分析手段。在该研究中，通过稳态和瞬态荧光光谱技术研究了8-甲氧基-3-羧乙基香豆素（8EMOHCC）在不同溶剂中被苯胺猝灭的荧光行为。稳态荧光测量如图8.（B）所示，随着苯胺浓度增加，8EMOHCC的荧光强度显著降低，但光谱形状和峰值未发生位移，表明无激基复合物形成。稳态S-V曲线在所有溶剂中均呈线性，符合动态猝灭特征，且猝灭常数KSV随溶剂介电常数增大呈非线性增加，表明溶剂极性通过调控电荷转移过程影响猝灭效率。

瞬态荧光实验如图8.（C）所示，通过时间相关单光子计数技术记录了荧光寿命衰减曲线，发现衰减呈单指数形式，证明猝灭过程均匀。瞬态S-V曲线同样呈线性，进一步确认猝灭为动态主导。通过多溶剂体系下的稳态与瞬态荧光联用，明确了8EMOHCC的猝灭机制为扩散与激活协同的动态过程，并揭示了溶剂介电常数的关键作用。该方法与结论对荧光探针设计、生物分子相互作用研究及光物理机制探索具有重要参考价值。（参考文献：Keerthana et al., J Fluoresc (2021) 31:393–400）

图8. （A）8EMOHCC分子结构。（B）8EMOHCC在丙醇溶剂中不同浓度苯胺的典型荧光光谱。（C）8EMOHCC与不同浓度苯胺在丙醇溶剂中的荧光衰减光谱。

5.环境监测

在复杂的环境基质中，多种污染物的共存对生态系统和公众健康构成重大威胁，通过荧光特征峰可以快速且灵敏的对目标污染物进行筛选，通过使用赖氨酸铜纳米团簇、半胱氨酸铜纳米团簇和氨基酸铜纳米团簇三种具有独特配体结合亲和力的铜纳米团簇（Cu NCs），与机器学习算法结合，可以区分多种重金属离子和农药。（参考文献：Varghese et al., Biosensors and Bioelectronics,2025,287(117706)）

图9. 三种铜纳米簇及其荧光激发光谱、发射光谱

6.食品安全

在食品科学中，荧光光谱技术作为一种快速、无损的分析工具，被系统应用于监测食物中化学成分变化。如图10所示，通过同步扫描和定点激发获取了牛奶在酸化过程中不同时间点的光谱数据，通过光谱变化解析牛奶酸化过程中的化学成分变化，再建立荧光指标与酸度的线性模型，实现酸化程度的准确预测，为开发实时监测设备提供理论基础，助力乳品行业的质量控制与优化。（参考文献：Sudhakar et al., Agriculture 2023, 13, 1054）

图10. 牛奶在光致发光激发下的荧光光谱特性

荧光光谱被用作核心分析手段，用于探究特级初榨橄榄油（EVOO）在激光诱导下的荧光特性及其掺假识别问题。研究采用405 nm连续波（CW）二极管激光作为激发光源，系统测量了EVOO及其掺假样本（如掺入葵花籽油SO）在不同探测角度下的荧光光谱。通过分析荧光光谱的强度分布和谱形变化，研究者识别出EVOO中主要荧光团（如叶绿素衍生物、类胡萝卜素和维生素E）的贡献。（参考文献：Duong et al., Microchemical Journal 214 (2025) 114023）

图11. （A）掺假橄榄油（B）特级初榨橄榄油样品在405 nm激光激发下的荧光光谱以及在不同检测角度下检测到的光谱及其分析