共聚焦显微拉曼光谱应用

共聚焦显微拉曼光谱

拉曼散射属于一种非弹性散射，是用来研究晶格及分子的振动模式、旋转模式和在一系统里的其他低频模式的一种光谱技术。其原理如下图1所示：

图1 分子跃迁能级图。不同的能级跃迁对应着不同的拉曼信号。线的粗细大致上表示了信号的强弱。

假设散射物分子原来处于基态，振动能级如图1所示。当入射光照射分子时，激发光与分子的作用使分子的极化率发生变化，相当于分子对光子产生了虚的吸收，从而使电子跃迁到一个虚能级（Virtual energy state），虚能级上的电子即刻跃迁到下能级并放出光子，即散射光。其中，绝大部分散射光与入射光频率相同，即在分子与光的相互作用过程中，没有发生能量的转移，这便是弹性散射，称之为瑞利散射；而有极小一部分散射光，与分子或晶格间发生了能量转移从而导致散射光频率改变，这部分散射便被称为拉曼散射。在拉曼光谱中，又把频率小于入射光频率的谱线称为斯托克斯线，而把频率大于入射光频率的谱线称为反斯托克斯线。 

由于不同分子或原子团的振动方式是一种，因而其拉曼散射光的频率也是特异的，因此，拉曼光谱也别称为“分子指纹"光谱。拉曼光谱的应用非常广泛，其可以表征材料的化学成分、化学结构、相与形态、结晶度以及分子相互作用的信息，另外，还能够获得晶体内的杂质、应力、以及温度等信息。

随着上述各个应用领域中被检测物的尺寸不断缩小，特别是进入微米甚至纳米尺度，对拉曼光谱的分析便要求提高其空间分辨率，因此，共聚焦显微拉曼光谱检测技术应运而生，其通过结合显微镜的显微放大功能，以及共焦孔的限域功能，可将拉曼检测的空间分辨率提高至光学衍射极限，即微米甚至亚微米量级。图2是共聚焦显微拉曼的典型光路示意图

图2 共聚焦显微拉曼光谱原理图

共焦显微拉曼光谱能够实现三维分辨能力，除了能够分析微纳米尺度的样品，还可以分析多层薄膜中不同的层和界面，透明样品表面下的杂质或污染物等。

通过点扫描或面扫描mapping功能，能够实现拉曼光谱的二维或者三维成像。通过提取mapping中每个点的拉曼信息，拉曼成像可以显示出各种材料属性(成分、结构、相、多形态、应力、结晶度)的空间分布。

共聚焦显微拉曼光谱应用

1.化学领域：

化学键以及对称分子的振动频率都是特异的，因此拉曼光谱提供了作为分子鉴别的重要手段。例如，SiO, Si2O2, 和Si3O3的振动频率是可被鉴别出来的，并列为红外光谱学以及拉曼光谱学配位分析的基础。拉曼位移的大小、强度及拉曼峰形状是鉴定化学键、官能团的重要依据。利用偏振特性，拉曼光谱还可以作为分子异构体判断的依据。在催化化学中，拉曼光谱能够提供催化剂及表面上物质的结构信息，还可以对催化剂制备过程进行实时分析。拉曼光谱是研究电极/溶液界面的结构和性能的重要方法，能够在分子水平上深入研究电化学界面结构、吸附和反应等基础问题并应用于电催化、腐蚀和电镀等领域。

（参考文献：Kraytsberg et.al., Journal of Power Sources 282.(2015):294-298）

图3 Li离子电池Si电极在充放电过程中的原位拉曼光谱

在评估Na₂S前驱体杂质对W掺杂Na₃PS₄合成的影响中，通过拉曼光谱可以分析得到Na₂S-d 在 481、498 cm⁻¹ 处出现多硫化物（Na₂Sₓ）特征峰，Na₂S-c 在 967、1005、1025 cm⁻¹ 处出现 SOₓ相关峰，Na₂S-p 在 2560 cm⁻¹ 处有弱峰，指示微量 NaSH（纯化过程中多硫化物还原产物），三者均在 207 cm⁻¹ 处有 Na₂S 强振动峰。因此结合其他技术可共同推断：Na₂S-c 主要含 SOₓ杂质，Na₂S-d 含多硫化物及微量 SOₓ，Na₂S-p 基本无这两类杂质，为后续研究不同杂质对电解质合成的影响提供纯净度可控的前驱体。（参考文献：Felix Schnaubelt et.al., Energy Mater. 2025, e03047）

图4 拉曼光谱分析商用 Na₂S-c、干燥处理的 Na₂S-d、纯化处理的 Na₂S-p的结构与杂质分布

2.食品安全

拉曼光谱法被用于检测牛酥油中不同浓度的非乳脂肪掺杂物，包括植物油、矿物油和猪体脂肪。在 774 cm−1（链烷烃 C–C/C–H 伸缩）、971 cm−1（CCH 面内摇摆）、1265 和 1656 cm−1（顺式-RHC=CHR 振动）处的特征拉曼峰能够清晰地区分这些掺杂物。（参考文献：Dinis et.al., Food Control,2025,178,111481）

图5 .牛油(CG)、矿物油(MO)、棕榈油(PO)、花生油(Gn0)、棉籽油(CSO)和猪体脂肪(PBF)的平均归一化拉曼光谱

通过拉曼光谱技术实现了温室菠菜硝酸盐的高精度、非破坏性定量监测，结合化学计量学模型，从复杂的光谱中提取出与硝酸盐浓度高度相关的特征，实现了对硝酸盐的快速、精确量化为精准农业提供了可落地的解决方案。（参考文献：Paolo et.al., Journal of Agriculture and Food Research,2025,21,101839.）

图6 菠菜叶的堆叠拉曼光谱

在特定范围内的光谱标记，源自于花青素和碳水化合物的振动模式，可以精确区分蓝莓与草莓、树莓、黑莓之间的细粒度区别，拉曼光谱提供了对这些浆果分子组成的更深入了解，而且为未来食品安全和质量控制的研究奠定了坚实的基础，为食品行业的质量评估提供了一种快速、无损和廉价的方法。（参考文献：Stephen et.al., Journal of Food Composition and Analysis,2025,137:106898）

图7 四种浆果样本提取物拉曼光谱

3.固态物理：

原料特性、量测温度和找寻样品的晶体取向。例如，对于单晶、多晶以及非晶的区分，拉曼光谱的展宽能够表征晶体质量，通过对特定声子模式进行监控，能够针对二维材料很快确定其层数和厚度。另外，拉曼光谱可以监测固体的低频激发，例如等离子体、磁振子和超导气体的激发。通过斯托克斯线和反斯托克斯线强度的比值，能够得知晶格的温度。（参考文献：Biplab et.al., App. Phys. Express, 7, 022401 (2014)）

图8 氮化硼纳米管（BNNT）的拉曼光谱，其中晶格温度通过计算E2g模式的斯托克斯和反斯托克斯线的强度比值得出。

4.生命科学

单细胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质含量等大量信息，可在不损伤细胞的条件下实时动态监测细胞结构变化，从而应用于细胞水平的疾病诊断（如癌细胞检测）、细胞药物处理、单细胞生命活动检测等领域。（参考文献：Freudiger et.al., Science, 322, 1857 (2008)）

图9 细胞内脂滴和细胞核内区域的受激拉曼散射光谱（左）和受激拉曼成像（右）。

除动物细胞外，共聚焦拉曼光谱也用于无标记、无损地可视化黄瓜（根、茎、叶组织中细胞壁的化学成分空间分布与结构特征，同时在分子和形态学水平上提供植物细胞壁复杂组织结构的多维信息。1598, 1621, 1658 cm⁻¹等位置的峰为木质素，1092 cm⁻¹ (C-C, C-O伸缩振动) 和 1337 cm⁻¹ (HCC, HCO变形振动)的峰，表明纤维素是细胞壁的主要成分，1523, 1156, 1005 cm⁻¹的强峰为类胡萝卜素特征峰。（参考文献：Beum et.al., Plants 2018, 7, 7）

图10 (A) 根、茎、叶木质部细胞壁不同亚区城采集的拉曼光谱

木质素、纤维素、类胡罗卜素在不同部位的拉曼成像(B)根(C)茎(D)叶

5.半导体

拉曼光谱可用于分析半导体材料的纯度，杂质、缺陷或污染物的分析，化合物半导体中合金成分、超晶格或异质结构的研究，应力或应变特性，离子注入后半导体的损伤分布，外延层的质量、组分、载流子浓度等。

图11 单个ZnO纳米环的显微图像（左），常规拉曼成像结果（中）和偏振拉曼成像结果（右）。

5.材料分析

拉曼光谱在材料科学中是物质结构研究的有力工具，可对各种薄膜进行结构分析，例如，单晶、多晶、微晶和非晶硅以及硼化非晶硅、氢化非晶硅、金刚石、类金刚石等碳材料等；可对耐高温材料的相结构进行分析，研究各种纳米材料的量子尺寸效应，分析高分子聚合物的分子结构和组成，立体规整性，结晶与分子链的取向，分子相互作用等。（参考文献：Wang et.al., Opt. Mater. Express, 10, 1092 (2020)）

图12 ReS2分子膜的拉曼光谱与mapping。

更多拉曼光谱技术：

1.共振拉曼光谱

通常，拉曼光谱的激发光能量与分子的吸收能级或固体中的能带并不匹配，因此分子对激发光子的吸收是“虚"的吸收，这也是本文一开始所指的电子吸收光子跃迁到一个“虚能态"。然而，当激发光能量与待测分子的某个电子吸收峰接近或重合时，这一分子的某个或几个特征拉曼谱带强度可达到正常拉曼谱带的104倍以上，并观察到正常拉曼效应中难以出现的、其强度可与基频相比拟的多级或组合振动光谱。常规拉曼与共振增强拉曼的原理如图3所示。（参考文献：Louis et al., Technol. Cancer Res. Treat. 12（4），371 (2013)）

图13 拉曼散射电子跃迁示意图。(a)常规拉曼散射；（b）共振拉曼散射

图14 正常与癌变的乳腺组织的共振拉曼光谱（532nm激发）

2. 表面增强拉曼光谱（SERS）

在特殊制备的一些金属良导体表面或溶胶中, 吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射信号大大增强，其主要分为以下两类机理：。

（1）电磁场增强机理, 主要是由于在金属表面发生表面等离子体共振, 这种增强效应与金属纳米粒子的大小和形状以及聚集结构密切相关；

（2）化学增强机理，主要反映纳米粒子表面化学活性位的性质，与探针分子与金属表面的成键以及分子吸附取向密切相关。

表面增强拉曼克服了拉曼光谱灵敏度低的缺点，可以获得常规拉曼光谱所不易得到的结构信息，被广泛用于表面研究、吸附界面表面状态研究、生物大小分子的界面取向及构型、构象研究、结构分析等，可以有效分析化合物在界面的吸附取向、吸附态的变化、界面信息等。（参考文献：Kouba et al., Raman. Spectrosc., 49(9),1426 (2018)）

图15 表面增强拉曼散射原理示意图。

图16 血液中的生物分子的表面增强拉曼光谱，其中上图为生物分子在玻璃基底上测得的拉曼光谱，下图为生物分子在纳米Ag颗粒表面上测得的拉曼光谱。

3 近场拉曼光谱

随着近场光学技术的成熟，将近场扫描显微镜系统作为外光路，与Raman光谱仪相结合，就能组成超分辨的近场Raman光谱分析系统。

近场拉曼可以同时获得样品的超分辨的物理和化学信息。拉曼光谱代表样品的化学结构信息，形貌图是样品的物理信息。结合近场光学扫描显微镜的特点，可以在样品的逐点采集拉曼光谱，在某一特定的波数形成拉曼光谱图。可能实现在单分子水平上对物质结构的研究。（参考文献：Steidtner et al., PRL, 100, 236101 (2008)）

图17 近场拉曼配置示意图。

图18 BCB分子在有针尖增强和没有针尖增强下的拉曼光谱。